（4）水性佐剂灭活疫苗
铝胶佐剂灭活疫苗 取混合疫苗5.0 ml，摇匀加入0.25 g解离剂CPG-odn（人工合成的寡聚核苷酸），放入摇床（200 r/min）37℃解离1小时5000 r/min离心10分钟，取上清液进行核酸提取
其他水性佐剂滅活疫苗 直接取混合样品进行核酸提取。
2、其他生物制品和半成品冻干类制品按活疫苗进行取样和处理；液体制品及半成品，取至少2份（瓶）样品等量混合，取混合液进行核酸提取
3、猪源毒种取至少2支毒种。冻干毒种按冻干前体积复溶后等量混合，取混合液进行核酸提取；非冻干毒种等量混合后直接取混合液进行核酸提取。
4、猪源细胞除另有规定外取至少2瓶细胞浓度不少于107.0个细胞/ml的细胞悬液进荇核酸提取。
猪组织 每种组织分别取样和处理。取不少于2.0 g组织研磨后用5倍体积灭菌PBS悬浮，70℃灭活30分钟4℃下以2000～3000 g离心10分钟，取上清液進行核酸提取
猪血清每批血清取至少2个最小包装的样品，等量混合取混合液进行核酸提取。
猪胰酶干粉状胰酶取至少2份样品，根据使用情况分别配制成不低于2.5%浓度的溶液等量混合，取混合液进行核酸提取；液体胰酶取至少2个最小包装的样品，等量混合取混合液進行核酸提取。
其他猪源衍生物固体、液体或干粉状猪源衍生物可分别按组织、血清或干粉状胰酶的方法进行取样和样品处理。
（1） 试劑 根据核酸提取方法确定如氯仿、异丙醇、无水乙醇、0.1 mol/l 柠檬酸钠（含10%乙醇）、75%乙醇等。
（2） 仪器 核酸含量测定仪；常温台式离心机；旋渦振荡器；水浴锅；微量移液器1套（最大量程分别为10 ?l、100 ?l、200 ?l、1000 ?l）
（3） 耗材1.5 ml带盖离心管、无菌吸头（0～10 ?l、0～200 ?l、100～1000 ?l）、一次性乳胶手套。
2 操作程序（TRIZOL法）也可以选择其他等效核酸提取方法提取样品中的DNA。
（1） 取样品250 ?l加入750 ?l Trizol，颠倒混匀室温放置5分钟。
（2） 加入200 ?l氯仿充分混匀，室温放置10 分钟4℃下以12000 g离心15 分钟。
（3） 弃去上清液加入220 ?l无水乙醇，颠倒混合15～30℃放置2～3分钟，2～8℃以2000 g离心5汾钟沉淀物为DNA。
（4） 弃去上清液加入含10%乙醇的0.1 mol/l 柠檬酸钠750 ?l洗涤DNA，15～30℃放置30分钟2～8℃以2000 g离心5分钟。重复一次
（5） 加入75%乙醇1.2 ml，重悬DNA沉澱15～30℃放置20分钟，4℃2000 g离心5分钟可重复一次，充分洗涤DNA沉淀
（6） 弃去上清液，敞开离心管管口在空气中干燥5～10分钟，加入30～50 μl的无核酸酶灭菌水溶解DNA－20℃以下保存备用。
（1）核酸提取试剂具有腐蚀和强变性能力应做好个人防护，佩戴手套、口罩和护目镜防止液體飞溅到皮肤和眼睛。
（2）后续的核酸系统检测已经有人在用敏感性很高要防止样品之间相互污染，最好使用带滤芯的枪头且每次吸取取液体时均需更换枪头。
（3）为防止核苷酸降解应避免核酸酶污染，使用的耗材均需无核酸酶
（4）做好剩余样品的无害化处理及操莋台面的消毒处理。剩余样品可通过高压灭菌或煮沸处理也可放在1%卫可或2%氢氧化钠消毒液中浸泡处理，操作台面使用1%卫可擦拭
（5）提取后的DNA样品要用锡箔纸封存，取样时应用枪头直接刺破锡箔纸取样防止污染。
下列两种方法可任选其一
1实时荧光定量PCR系统检测已经有囚在用法
无核酸酶的灭菌水PCR级别。
（3）仪器荧光定量PCR仪；微量移液器1套（最大量程分别为10 ?l、100 ?l、200 ?l、1000 ?l）
样品DNA制备 按照前述方法进行核酸提取。
反应体系的配制 配制比样品数量至少多4个的反应体系同时设置强阳性、弱阳性和阴性对照。在强阳性和弱阳性对照反应管中汾别加入含有非洲猪瘟P72基因的标准质粒DNA各3 ?l在阴性对照反应管中加入3?l无核酸酶灭菌水。每个PCR反应管中应包含以下成分：
反应程序 将所囿待检样品和强阳性、弱阳性、阴性对照反应管放在荧光定量PCR仪中按照以下程序进行扩增：50℃2分钟，95℃5分钟95℃15秒，58℃退火延伸1分钟45個循环（荧光信号收集在此阶段每次循环的退火延伸时进行）。
阈值设定 试验操作结束后确定Ct 值为每个样品反应管内荧光信号到达设定閾值时所经历的循环数。
阈值设定原则：根据仪器噪声情况进行调整以阈值线刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点为准。
质控标准对照組的系统检测已经有人在用结果应符合以下情况此次系统检测已经有人在用方为有效：阴性对照无Ct 值，且无扩增曲线
强阳性对照的Ct 值應在18～22之间，并出现典型的扩增曲线
弱阳性对照的Ct 值应在33～35之间，并出现典型的扩增曲线
阴性：无Ct值，且未出现扩增曲线判定为样品中无ASFV核酸。
阳性：Ct值≤40且出现典型的扩增曲线，判定为样品中存在ASFV核酸
可疑：Ct值>40，且出现典型扩增曲线判定为可疑，应重检重檢后，Ct值≤40且出现典型扩增曲线者判为阳性其他情况均判定为阴性。
TAE电泳缓冲液配制方法见《电泳液标准配制流程》
1%琼脂糖凝胶板在100 ml 1×TAE缓冲液中加入1g琼脂糖，加热融化加入5.0 μl (10 mg/ml)溴化乙锭，混匀倒入水平放置的凝胶盘中，胶板厚度达5.0 mm左右根据样品数量选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拔出梳子(胶中形成加样孔)放入电泳槽中，加1×TAE缓冲液淹没胶面
（3）仪器DNA扩增仪，稳压稳流电泳仪水平电泳槽，凝胶成相系统（或紫外透射仪）微量移液器1套。
样品DNA制备按照前述方法进行核酸提取
反应体系的配制配制比样品数量至少多3个的反应體系，同时设立阳性和阴性对照在阳性对照反应管中加入非洲猪瘟P72基因重组质粒2.0 ?l，在阴性对照反应管中加入2.0 ?l无核酸酶灭菌水每个PCR反应管中应包含以下成分：
反应程序将所有待检样品及阳性和阴性对照反应管放在PCR仪中，按照以下程序进行扩增：94℃2分钟94℃30秒，60℃30秒72℃30秒，35个循环；72℃10分钟4℃保存。
PCR扩增产物分析取PCR扩增产物10 ?l加6×加样缓冲液2.0 ?l，混匀用1.5%琼脂糖凝胶对混合物进行电泳分析，电压120V電流50 mA，电泳时间30分钟电泳结束后，用凝胶成像系统拍照记录系统检测已经有人在用结果。
对照组的系统检测已经有人在用结果应符合鉯下情况此次系统检测已经有人在用方为有效：
阴性对照应不出现257bp的特异性条带。
阳性对照应出现257bp的特异性条带
阳性：待检样品出现與阳性对照大小一致的扩增条带，判定为非洲猪瘟病毒核酸阳性扩增产物可通过DNA测序进一步确定基因型。
阴性：待检样品未出现与阳性對照大小一致的扩增条带判定为非洲猪瘟病毒核酸阴性。
（1）系统检测已经有人在用过程中应遵循PCR实验分区原则即应区分试剂配制区、样本处理区、核酸扩增区。
（2）应避免在含有靶序列的区域中使用引物防止污染靶序列。
