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【专题讨论】有关EMSA的问题
我是用PIERCE的EMSA试剂盒的，显色发光很好，但不知为何，最后的图像总是很弥散，不同处理样品显色“团”确实有前后位置的不同，而不加蛋白的只有标记探针的带宽就比较窄，而且在最前端，说明不是结合、标记、显色等问题，UV交联我用过302nm，10min,15min,20min，但没改变什么。而盒中的对照品更无结果，可能蛋白降解了。郁闷，请求侠们帮助。xiexie。左起1道为无蛋白的，2－5为不同样品。
screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=266 height=251 title="Click to view full 4.jpg (266 X 251)" border=0 align=absmiddle>探针上是不是有很多蛋白的BINDING SITE 啊？有没有试过暴光时间短一些的？EMSA 要在正常实验前要试一下不同BUFFER，高盐低盐等对结果的影响，建议从头摸索一下实验条件。你的条带弥散的厉害，是不是跟胶聚合有关系阿。你配胶的试剂是否新鲜，聚合是否充分。核酸电泳的时候，胶不好跑出来有时就会像上面那样，拖拖拉拉的。你的现色试剂又特别灵敏，所以…………班门弄斧了，说得不对大家别笑我。谢谢楼上2位，试过与曝光时间没关系，胶聚合也好啊，有一次放了20分钟才泳的也一样。：（20分钟根本不够得至少40分钟（以前实验室老师说的，他都是上午配胶下午电泳，跑的是那种大长的测序胶），天冷的时候还用灯烤呢如果这样说，蛋白电泳时的胶也是一样吧？可是蛋白电泳不会这样啊。不管怎样我的去再试一次，聚合2小时看看，是有人跑长胶，可我们没有。thankyou可能是你的结合不好，DNA和蛋白质开始是结合的，但是在跑胶的过程中不断分离，拖的太开了，建议直接和美国Pierce TA联系，鬼子态度非常好。thanx, I had tried. anyway my results are much better now.如果有机会可否把改进后的图片贴上来，并把改进的方法跟大家分享？Ok，that's due to the sample quality. 样品可能由于保存不好浓度太低了，后来重新提了，就很简单的出来了（2－5ug）。另外做这个最大收获是发现按照PIERCE说明只能做10次的试剂盒其实可以做100次，至少几十次了。（但我已经不能达到了，因为最开始还是老老实实严格按照上面来的，而且dI-dC比较少），他的blocking buffer 可以重复应用5次；而生物素标记的抗体每次用5ul足已（in 1-1.3ml blocking buf）将膜倒扣其上孵育即可（说明书用66.7ul in 20 ml buffer）；显色液每次各0.4ml（说明用各6ml），平衡液也可以重复用。不能重用的只有washing buf. 其实也就是SSC吧，也能自己配的。
screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=102 height=169 title="Click to view full 6.jpg (102 X 169)" border=0 align=absmiddle>不过要声明啊，盒里的dI-dC是不够用到100次的了。楼上这位仁兄，你贴的照片终于让我又看见了曙光。我用非放射性的方法做EMSA已经有5个多月的时间了，但一直都遇到和sophie1011大致类似的情况，从结合条件、电泳条件、转膜条件，曝光时间各个方面能摸索改进的都摸了，虽然有改善但仍然无法清晰的分辨特异的结合条带。我用的是罗氏的Dig gel shift assay kit ,眼见着试剂都用得差不多了，可是结果总是不好，也不知道是哪个环节出了问题。非常希望能就实验方法的一些具体问题向你请教,以及你觉得实验中的一些关键因素请赐教。谢谢！请问怎样把照片贴上来呀？楼上的，我也是用roche的，条带也是模糊不请，是不是罗氏的东西质量不行呀？另外：请教一下，大家用的是大的电泳槽还是小的？会不会小的分不开？hi好久没来这里了，sorry。tulips2000， 萧翎。能帮上你们什么的话我也开心。1。传照片：点击本页面的右上角
“ new reply”, 那里就有的传了。2。模糊：以我的失败经验看：（1）核蛋白问题 （2）胶聚合时间不够（应该大于4小时（25度的温度话，天气热时，可以适当减少时间））3。我用的是小槽，普通电泳的那种，能分开的。4。要预电泳5。交联：膜要干些，时间：我是用凝胶成像分析仪 代替的，302nm紫外透射灯照20min比说明书的时间要长，不过这个与不同的紫外灯质量及功率相关，得试试。6。忘了说重要的一条：地高辛的不如生物素敏感。你们可以加多蛋白和/或标记探针，在一个胶上用一份好样品，试试。7。用别人的蛋白试下。如果资金允许，最好换PIRECE的吧，我以前做不出的western用他的发光试剂久出了，一举两得。谢谢yfyu1963，贴一张我做的片子，麻烦帮忙分析一下。你提到的几点我都注意了，比如，凝胶我一般过夜，用的是一般的国产蛋白电泳槽，十来公分长，跑80V
3-4小时，DNA交联我用的是120度烤半小时，效果至少free probe还是比较清楚的。不知问题是否出在样品上，我提的核蛋白的浓度并不低，大约50-100ug/细胞，每个样本中用5ug蛋白。试剂盒带了oct2A的纯化品和探针，他们的结合带基本上每次都能出来，只是我发现随用的次数增多，探针的显色效率降低了，而我粗提的蛋白就是没有清楚的结合带，更别说什么supper shift 了。也不知怎样才能确定我的蛋白是可用的？另外就是控制结合条件是否也很重要呢？
（缩略图，点击图片链接看原图）1你的说明书要求80V 3-4HR?试试100V 50MIN，时间短降解少。2其实只要阳性对照出来了，至少说明条件没错。3加了AB的那个未见结合条带，说明你的结合特异啊，我看相当于SUPER SHIFT。4粗提？还是按照先去掉胞浆蛋白，再提核蛋白的方法吧，纯些，感觉还是这个问题，蛋白浓度是总蛋白浓度还是核蛋白啊？5肯定有别人也用核蛋白的，要点一起跑跑。谢谢！我的情况是这样的：1，说明书要求电压8v/cm，溴酚蓝到接近底部1/3时停止，我用80V至少要3小时，100V也跑过，大概2小时左右指示剂到凝胶中部，不知是不是该找个高级点的电泳装置试试。预电泳我用120V半小时。2，我是按常用的提核蛋白的方法进行的，先去掉胞浆蛋白再用高盐裂解液把核蛋白提出来，上次给的是核蛋白的浓度。3，与蛋白结合的探针应该在哪个区域呢？我觉得应该在胶的上半部分，你说呢？所以上次的照片为什么是那样我想不好用super shift 解释，呵呵，不知道对不对。因为除了我要的特异结合带外应该是有不少其他的核蛋白也能与探针结合的。4，下次我一定用点别人的蛋白试试5，探针量应该用多少？我以前用30fmol每样本，都很清楚，大约作到10次以后用这个量根本什么都看不见，后来加到90fmol就出来了，重新标记会否好些呢？tulips2000 ：与蛋白结合的探针应该在哪个区域呢？我觉得应该在胶的上半部分，你说呢？所以上次的照片为什么是那样我想不好用super shift 解释，呵呵，不知道对不对。因为除了我要的特异结合带外应该是有不少其他的核蛋白也能与探针结合的。是啊，本来是该在上面的。但看下面的又象啊。你能再贴个对照阳性（你觉得最好的）的片子上来么，不然搞不清楚是啊探针也可以降解啊，我看加多少以你的实验结果为准我用的是BIORAD的电泳槽，你电泳液都是新的么，旧的就跑慢。遗憾的是我没有做过阳性对照。我要测的是STAT，那阳性对照是不是需要纯化的STAT蛋白与探针孵育后的结果呢？不知哪里能弄到，买的话好象很贵，是必须要这样的对照吗？我一直觉得现在用的电泳装置太差，是咱们学校开本科生实验用的，两快玻璃卡在胶条里然后往槽里一插，拧螺丝到手发麻，不是漏胶就是漏缓冲液。不过缓冲液我挺注意的，配5*TBE贮存，每次临用前新鲜配制稀释的，从没重复用过。TBE应该可以高压吧。遗憾的是我没有做过阳性对照。我是指你的试剂盒中的那个OCT。。 它能说明你这个实验系统的问题啊。TBE应该可以高压吧。 不知后果怎样，但肯定的是，不用！！从没听说过。你用纯水配就得了。胶浓度你用的多大？UV交联前用真空干胶仪将胶抽干，室温下很容易弥散的。刚刚用普洛麦格的试剂盒做完EMSA，因为没有干胶仪带也有些弥散，但是我的是在－80度条件下所以结果还可以。wilma2004 wrote:UV交联前用真空干胶仪将胶抽干，室温下很容易弥散的。刚刚用普洛麦格的试剂盒做完EMSA，因为没有干胶仪带也有些弥散，但是我的是在－80度条件下所以结果还可以。你是用放射性标记的吧。非放射标记的需要转膜后再交联的。这张照片前3个泳道分别是-oct , +oct , +oct +竞争未标记探针，我是为了让TBE贮液能在室温下多放一段所以高压的，看来多此一举了，呵呵！而且每次都用三蒸水（我们实验室只有单蒸和三蒸水），看来也没必要吧，是不是相比之下电泳装置更重要些？胶的浓度是5%我做的片子背景一般都不太好，所以转膜后washing,blocking,detection buffer 和抗体溶液一般都是用新鲜的，容器和试剂基本上都高压，所以每次觉得特麻烦。但看你上次贴的片子就挺好的。？
（缩略图，点击图片链接看原图）tulips2000 wrote:这张照片前3个泳道分别是-oct , +oct , +oct +竞争未标记探针，从这张看，结合带应该在膜上部；你的条件与上张的一样的话么？（不像啊）包括探针量，蛋白量，电泳条件？tulips2000 wrote:我是为了让TBE贮液能在室温下多放一段所以高压的，看来多此一举了，呵呵！而且每次都用三蒸水（我们实验室只有单蒸和三蒸水），看来也没必要吧，容器和试剂基本上都高压，所以每次觉得特麻烦。是不是相比之下电泳装置更重要些？不用的，只要你的EP管是高压的就行了，其他的自来水洗干净就好，再用纯水涮一下。电泳槽，只要可以恒压恒流就行了，应该不大影响tulips2000 wrote:胶的浓度是5%我做的片子背景一般都不太好，所以转膜后washing,blocking,detection buffer 和抗体溶液一般都是用新鲜的，但看你上次贴的片子就挺好的。？你延长一下洗的时间吧。象是洗的不干净。还有，为何你上面写“显色后18h”是显色后等18H才曝光么？1.我觉得凝胶时间不必要这么长，我现在凝胶时间大约只有40min左右，我觉得效果也还可以，2.大家都在说核蛋白，我觉得量少不是问题，关键是纯度如何。我是用pierce的试剂盒提的，第一次只有0.5-0.6ug/ul，用量增加就可以了，效果没有什么影响。3.我用的也是120c烤膜半小时的方法，效果不错。紫外交联，没用过。4.探针是按roche上的方法标记的，效率还行，和control一样亮。5.我觉得你可以试试把胶的浓度提高一些，我用6-8%的，这样可能不会这么弥散。6.好像确实有些脏，washing的时间长一些。胶我马上去扫～～我到有个问题想请教一下：
就是加样孔处有很多标记探针的残留，不知怎么回事。大家帮忙分析一下～～
（缩略图，点击图片链接看原图）不错啊，你稀释10-20倍探针看看，PIERCE灵敏。可以再跑久点。干吗上面有格子？稀释10-20倍？我想问一下你一般每孔加多少量的探针？跑久一点，游离探针不就没了？有格子是因为我拿着科研记录本去扫描的：）请教yfyu1963 ：
我刚买了PIERCE的EMSA试剂盒，要做NF-KB。有些问题想咨询：
1.胶的配方（5%）
2.转膜时也和WESTERN 一样要在冷室进行，也要用冰盒吗？
3.作binding
reaction 的时候，许多optional的东西，如甘油、NP-40、EDTA等你都加了哪些？如何摸条件，变动因素太多了。可否告知最大众化的条件？
4. 跑胶时，多余的孔是空着，还是加loading buffer?
5. 探针是用DDW稀释吗？生物素标记的探针你一般用多大浓度？游离探针的浓度？
6. 如果有可能，可否将你实验中的宝贵经验写出，让大家一起分享。
非常感谢。adzcat wrote:请教yfyu1963 ：
我刚买了PIERCE的EMSA试剂盒，要做NF-KB。有些问题想咨询：
1.胶的配方（5%）
2.转膜时也和WESTERN 一样要在冷室进行，也要用冰盒吗？
3.作binding
reaction 的时候，许多optional的东西，如甘油、NP-40、EDTA等你都加了哪些？如何摸条件，变动因素太多了。可否告知最大众化的条件？
4. 跑胶时，多余的孔是空着，还是加loading buffer?
5. 探针是用DDW稀释吗？生物素标记的探针你一般用多大浓度？游离探针的浓度？
6. 如果有可能，可否将你实验中的宝贵经验写出，让大家一起分享。
非常感谢。1. 5%聚丙烯酰胺配制
30%聚丙烯酰胺
4.4mL5 x TBE
0.6mL10%AP
15μLTEMED
4μL 聚合约4hr后预电泳：100V，60min。2。我用了冰河。3。不加optional的东西就是普通条件啊，我加这几个都加了：）主要是习惯了，最开始不好时什么都加上了。但应该不会产生质的影响。4。可以空着5。是水稀释的，浓度要试试，每个人的可能不同，我50 竞争时加100或200倍的非标记。但一般不加非标记的（你好像弄混了游离（未结合探针叫游离）与非标记啦，）。6。我写了，在前面呢。萧翎 wrote:稀释10-20倍？我想问一下你一般每孔加多少量的探针？跑久一点，游离探针不就没了？有格子是因为我拿着科研记录本去扫描的：）如果你不是倒着给大家看的话，游离探针离跑没不是还远着呢么。标记探针目的不就是显影么，既然你影那么浓就可以少加探针的啊yfyu1963 wrote:如果你不是倒着给大家看的话，游离探针离跑没不是还远着呢么。标记探针目的不就是显影么，既然你影那么浓就可以少加探针的啊yfyu1963,你看到的是目的条带，探针早跑没了。而且每次加了核蛋白的孔游离探针都特别少，不加蛋白的能看到游离探针，我还怀疑探针少了呢。要不就是蛋白加太多了。最上面是加样孔，我也在想为什么孔里有这么多残留？谢谢yfyu1963 的热情回答，有问题将来继续请教。to han:核蛋白提取方法：核蛋白提取缓冲液：BufferＡ: 10 mM HEPES， pH7.5， 10 mM KCl5 mM MgCl21 mMＤTT5%甘油1 mMＥDTA2 mM PMSF1 mM Na3VO410 mM NaF3 &g/mL aprotinin3 &g/mL leupeptin2 &g/mL pepstain Buffer B: 20 mM HEPES， pH7.5420 mMＮaCl1.5 mM MgCl21 mM EDTA0.5 mM DTT1 % NP 4025%甘油 2mM
PMSF5&g/mL aprotinin5&g/mL leupeptin3&g/mL pepstain 3.7.1. 提取核蛋白[1]： (1)&&将细胞收集于离心管中离心， -20℃放置5min(2)&&沉淀重悬于300μL BufferA冰置15min(3)&&加入0.5 % NP 40，振荡15sec(4)&&4℃，500g离心， 10min(5)&&弃上清液（为胞浆蛋白）(6)&&沉淀（核蛋白）重悬于50μL预冷BufferＢ中，混匀， (7)&&冰中20min，间歇振荡(8)&&4℃，14000g离心， 15min(9)&&取上清，即为核蛋白。(10)&&蛋白定量，分装，保存 -30℃。to han:你可蒋核蛋白和胞浆蛋白一起电泳一下看看，可以看到有些条带的宽度明显不同，条带数目也略有差别。这样可以间接鉴别你提取核蛋白的质量
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凝胶迁移实验――EMSA
凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析，这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
原理：通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针，常见EMSA实验设计一般分以下三种：
1、野生型探针竞争：野生型冷探针与热探针竞争结合核抽提，从而证明复合物是探针和核蛋白的特异结合产物。
2、突变型冷探针竞争：将探针上的转录因子结合的核心序列突变后，再与野生热探针和核抽提物孵育，该结果可以证明复合物的形成取决于核心序列。
3、Supershift实验：在反应中加入预测转录因子的抗体，由于抗原抗体特异结合，使复合物分子量增大，出现超迁移条带，该结果可以证明复合物中含有预测的转录因子。
采用EMSA可以直接验证：转录因子与miRNAs启动子的结合（蛋白：DNA复合体）；调控miRNAs的成熟过程。
EMSA的特殊作用：Supershift替代Western Blot检测结合蛋白的种类；设置不同的探针来判断miRNAs与蛋白的结合序列。
客户提供：目的基因信息，生物素标记探针；特异性抗体。
我司提供：EMSA结果图
相关自主发布用过感觉比较好才敢推荐，哈哈那我要买NF-KB的；NF-KB探针自己标记，斑点杂交检测效率约为50；emsa的page胶：；5*TBEbuffer2ml；水14.2ml；29：1arc/bis3.2ml；80%甘油600ul；10％ap150ul；temed10ul；凝聚3小时后，上样，无溴芬兰；（说明书上说10×的TBEbuffer使用1ml；是不是说明书
用过感觉比较好才敢推荐，哈哈那我要买NF-KB的探针工作液,我不想费事,我需要可以做人和小鼠的生物素标记的探针,最好能保存时间长些.不知哪个质量好的公司肯单卖这个探针?多谢关注!!!谢谢楼主,推荐一下好的尼龙膜吧!大体说一下过程，楼主帮看看原因所在： 使用碧云天gs009试剂盒。
NF-KB探针自己标记，斑点杂交检测效率约为50％，没有纯化探针，杂交结果尚可。 但是核蛋白结合后转膜杂交根本没有信号，主要过程如下：
emsa 的page胶：
5* TBE buffer 2ml
29：1 arc/bis 3.2ml
80%甘油 600ul
10％ap 150ul
temed 10ul
凝聚3小时后，上样，无溴芬兰。
（说明书上说10×的TBE buffer使用1ml，我的是5×buffer，使用2ml对么？
是不是说明书上的10×意思是稀释到0.5×，所以我的5×buffer可以理解为10×buffer？？） 转膜
0.5× TBE buffer 作为缓冲液
380mA,60分钟。这次制冷效果不好，出现胶黏到膜上的情况了，但是我多转了两个无关蛋白，剪膜下来使用立春红染色效果很好（虽然有胶的碎末在膜上，但是蛋白条带清晰可见） 出现胶黏到膜上的情况是不是因为产热太多？？？
交联和显色
这些步骤和检测效率的方法一致，斑点杂交检测效率感觉很好，但是不知怎么的，预实验四次了，转膜后的显色结果总是惨不忍睹，楼主及各位有什么高见？
这是最近一次结果，如下（从左到右顺序,电泳方向从上到下，无冷竞争泳道： 游离标记探针泳道 结合泳道1 结合泳道2 空泳道）：
（缩略图，点击图片链接看原图）奇怪的是，连游离非结合探针泳道也没有成形的显色，而探针直接点膜杂交显色的效率检测结果很好，为什么会这样？ 转膜和核蛋白结合有什么问题么？楼上的哥们，你写的很多，问题也很多，最起码的探针没有纯化都敢用！！！这个危害很大的啊！
纯化的问题没解决，后面的实验结果就是操作在对也不实在了！！！楼主的帖子实在太好了,我也和各位EMSA的实验同志们一样遇到一些问题
我4年前也做过EMSA,是同位素标记的,在别人的实验室,一切条件都很成熟,我就没遇到什么问题,重复三次结果都很好,文章也发表了,点值还比较高,但我对可能遇到的问题就没办法解决了.
现在我用生物素进行标记,用的碧云天的KIT,也遇到楼上一位兄弟所遇到的情况,我用KIT的自带探针检测标记效率,显色时膜上一片荧光,肉眼都可以看见.HRR的稀释比例是按KIT推荐,我怀疑是紫外交联的问题.今晚按楼主推荐超净台10cm下10分钟,HRP也将稀释浓度提高一点,试试看,有好的结果向大家报告.
也不知那位兄弟的问题解决了没有,如果封闭液\洗涤液\平衡液出问题就只有找公司了.有一个情况我刚忘写了
不知封闭液\洗涤液\平衡液各起什么作用,
封闭液\平衡液都用的KIT的原液,洗涤液KIT推荐用重蒸水或miliQ级水1:5稀释
现在的实验室没有,我用的去离子水稀释,会不会是洗涤液没有作用,导致整张膜都发荧光为
我是第一次做，所以按照盒子上的建议说不纯化也可以，我怕纯化后丢失，所以没有纯化。纯化的时候能加糖原载体么？为什么呢？
我是第一次做，所以按照盒子上的建议说不纯化也可以，我怕纯化后丢失，所以没有纯化。纯化的时候能加糖原载体么？报告大家,我今晚用没有稀释的KIT自带探针、HPR稀释比例1:4000，检测到了!!!!说明紫外交联及之后的步骤都没有问题。
不过膜上还是在暗处肉眼可见一片荧光，说明KIT推荐的HPR稀释比例1:3000过高，下次还需调整到1：5000，否则背景太深。
同时还说明了一个问题，KIT自带探针的标记效率也不高，按它介绍的最高1：50稀释根本检测不到，更不要说1：100，1：500及更低的稀释比例了。
我标记的探针纯化过，没稀释的也没检测到荧光，看来标记效率就更差了，但还是鼓起勇气往后做做看，退火后再检测一次双链的效率，然后再继续走完看看。
青石战友如果将探针纯化后能检测到标记效率再来看后续的实验吧。
其中提到的一些问题：冷竞争指没有标记的探针进行的实验，Poly dI-dClouPolydI-dC的作用楼主在前面已经叙述非常清楚;
转到膜上的是蛋白质-DNA复合物,探针,蛋白质,只有探针和结合了探针的蛋白质最后会检测到荧光;
我没有发现什么地方需要去除SDS
EMSA胶中的甘油的作用我不是很清楚,是否可以请教下楼主纯化的目的是去掉没有标记的双联, 而发光的是标记好的双联,但是结合蛋白的只要序列相同都可以结合,所以如果是阳性可能变成弱阳性,弱阳性可能就是阴性了!
没有纯化,从根上就没有过关,后面的问题就更大了!!!sds会变性蛋白,蛋白变性了就没有结合活力了,EMSA试验就失去意义了,
凝胶种的甘油主要是调节样品和胶的渗透压平衡!!!可是kit的纯化方案就是酒精沉淀啊，那不是标记和未标记的都沉下来了么？
谢谢你的回答
另外想请教一下，为什么叫冷竞争？ 冷指什么意思？
再次感谢SDS的作用我知道,在EMSA实验中没有什么地方需要用SDS啊,当然也就不用去除
是因为青石战友有这么一问,所以我不明白他在什么地方需要去除SDS
青石战友提到的冷竞争
指的是没有标记的探针和标记的探针进行竞争结合靶蛋白上的结合位点
按青石战友的提法,冷在这里可以理解为没有标记的探针哦 有意思呵呵
那么说标记放射性探针称之为热探针了？！
我们知道emsa的装置肯定是和蛋白电泳混用的，但白点用的sds会残留的，所以我才说去掉sds，不知痕量级的sds有没有影响？
谢谢回答，祝讨论愉快。问题1 ：
可是kit的纯化方案就是酒精沉淀啊，那不是标记和未标记的都沉下来了么？
标记放射性探针称之为热探针了？！
凝胶种的甘油主要是调节样品和胶的渗透压平衡! 如何起作用的？
抱歉 问题越来越愚钝了青石战友用的是不是碧云天GS008KIT?
我刚发现它的说明书有个很大的错误!!!!!
(不知以前 用过它家KIT的战友用的情况怎样,还是我自己做不出来找的原因)
我想先请问下你在进行效率检测时是在它推荐的哪一个浓度上检测到荧光的?
看你前面的介绍,你是用的点杂交的专门设备吗?
我就是直接点到膜上进行检测的,只有KIT的自带标准品没有稀释的情况下(400nM)可以检测到荧光.
按照它的说明书探针标下来顶天达到20nM的浓度,根本检测不到,更不要说后续实验了. 我已经给公司发email了,希望大家一起探讨,尽快将实验开展起来!!!呵呵,探针的制作不是那么容易的!!!尤其是自己以前没做过,然后买盒子来作,把握很不足的!!!哪里可提供生物素标记服务呀？谢谢了！可以买现成的,不过只有常用的几种!比如NFKB, SP3等谢谢楼上的，可是哪里可以买到现成的啊，碧云天不提供这种服务。我就是做NFkB的VIAGENE , 给你发了pm消息, 你自己看吧!青石战友用的是不是碧云天GS008KIT?
是的，但是我觉得我的问题是探针上。
探针也是碧云天的 好像有问题 ，但是直接点膜很好，一跑胶就非常模糊，我今天用银染看了一下，探针和蛋白结合的泳道几乎什么都没有？？？？
而且单纯探针整个泳道黄乎乎的，真是晕死啊？难道反应过程中把我的探针消化掉了？？？？有没有这个可能？？
另外，今天重提了蛋白 但是检测显示在225和310各有一个吸收峰值，为什么呢？280周围没有吸收峰？
问题多多啊 谢谢回答楼上的战友，我也用的碧云天的标记KIT
在标记的50ul体系中，有water, TdT, TdT buffer, probe, Biotin-11-dUTP
其中Biotin-11-dUTP的终浓度可达到0.5uM,
探针纯化可去除TdT buffer和Biotin-11-dUTP
没有纯化的探针点杂交效果虽好，但是要考虑是Biotin-11-dUTP的贡献，实际探针的标记效率并不高，这对后续实验影响是致命的。
我开始用的NC膜，暗室一片荧光，杂交效果一塌糊涂
前面也有战友提到暗室里看到膜上一片荧光的状况，估计也是用的NC膜
换用尼龙膜后就没有背景了，边摸索条件边把经验告诉大家，避免走弯路。今天跑了下胶,150V, 1h,10mA
转膜用的是Bio-Rad半干转印仪,开始380mA恒流,电压从开始的25V转10分钟后达到95V;我担心电压太高,发热,又改为25V恒压,20min,电流在128mA,转膜完发现还是有些发热,胶比较模糊,在空泳道上点的溴酚蓝倒是完全转到膜上的.跑胶后泳道没有变黄,是转膜后膜局部有些发黄.我在跑胶时也跑了一个多余的蛋白,转膜后用丽春红染色检测下转膜情况,在加样孔下方仿佛有一条带,而且尼龙膜就没法洗干净,整个红透了.我想是因为EMSA电泳条件和转膜条件\膜都和Western所用不同,没有可比性.只有最后化学发光检测才知道. 今天没有时间做后面的实验,可怜啊,没有暗室,只有明天天黑了来做实验.
PS: KIT推荐的是湿法电转膜装置,390mA(100V) 30-MIN,转印槽放冰浴中.
我想请教下楼主:
1.请问你用的是湿法电转还是半干电转?转印过程是恒流控制吗?那电压大致在什么范围内?
2.转膜后膜会不会出现变黄的现象?需不需要象western那样,转一个多余的蛋白,然后剪膜丽春红染色大致检测下转膜情况?
先谢谢了!呵呵, 好几天没来,好热闹啊!!!
楼上的哥们,
我发在坛子里的操作步骤和试验条件都已经是经过好几百次试验后的结果了,你怎么还在这
好好看看我给你的中文操作步骤, 没必要在模了, 在模都是浪费你的时间和费用,呵呵~ 尼龙膜不能立春红的,要是染了就废了,呵呵! 洗不干净的!!!
我一前试过! 呵呵湿法电转: 390mA 横流40min
电压基本在港开始70-80V
40min后电压50-65V
不同电泳仪器,稍微有点差异@但是要考虑是Biotin-11-dUTP的贡献
你说得对，但是生物素能固定到膜上么？我不知道，但是不排除。
第二我用变性非变性page检测了一下探针，发现探针泳道没有任何东西，不管是标记未标记。是不是探针完蛋
了？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？晕死！探针也是买的碧云天的，今天自己合成了，真是！！！生物素是标记在基因序列上，膜结合的是DNA和蛋白，交连后就很牢固了，所以，一般来讲没什么问题，除非你的探针有问题，那就是实验根本的问题了！！！这个很重要！！！探针问题是基本的问题，也是很重要，关键的问题！一定要重视！
如果探针搞不定，后面操作在正确都不会拿到结果！游离生物素能标记在膜上么？ 探针检测使用银染可以么？
谢谢。自由探针可以结合到结合膜上！！！，
不过我还是觉得你没有必要把那些时间和金钱浪费到自己搞探针上，好一点的还是买个现成测定好的工作液合适！除非你是研发自己的探针，呵呵，这东西不好弄，我们实验室的都是国外专业公司定制的，老实说人家做的确实不错！！！你是说游离生物素能标记到膜上？ 嗯，我也打算买一个现成的算了。emsa真的就是蛋白和探针的问题，大实话啊。当然，你看一般的图片都有自由探针在底部，都是转运后经过紫外教练结合在结合膜上面的！我也是做NF_KB的EMSA实验，低温下电泳80分钟，转膜显色后，整个膜长约5CM，发现自由探针和探针+蛋白两条带之间很近（&0.6CM），而且在加样孔下面0.5CM处有一条明显的带（较探针+蛋白带亮），这条带与探针+蛋白带之间距离很远（&2.5CM），自由探针带很亮，请问战友，自由探针与探针+蛋白之间的距离有多远呀，那个加样孔下面明显的带怎么解释呀，我都怀疑这个探针+蛋白带是不是真的呀？收藏，谢谢！准备做EMSA，要从组织抽提蛋白，怯阿！以后有问题在具体请教！按照你的说法，应该上面的那条带是阳性带，但是为了确保，建议做个冷竞争对照确定一下！挨着探针的那个应该是非特异的带！～组织的蛋白有时候也不好提取，注意专用的EMSA试剂盒，和相关文献的查询！！！谢谢版主，今天再次做了一下，阳性对照（用皮尔斯公司的样品）、阴性对照、冷竞争和突变冷竞争都做了，加三个样品共做了七条带，但割胶的时候没留加样孔下0.5CM以上的地方（我昨天怀疑它是非特异性带，探针以上的那条带为NF_KB带），结果今天所有自由探针上面都有一条带，现在我把昨天的图片和今天图片都发过来，请你帮我看一下。这是昨天的图
3.tif (219.55k)不好意思，我本来想把图片改成JPG格式上传的，但一更改就非特异性条带就没有了，所以就用文件夹上传了，麻烦你再帮我看一下今天的图片。
4.tif (219.55k)的3，4两张图，就图片而言，我倒是觉得上面加样空下面0.5cm处的那条带可能是阳性的带，我一般做NFKB－EMSA实验，结合膜的长度大概是7cm，底部是自由探针，上面的位置是阳性的结合带！这个主要和你的电泳时间有关，下面的都是非特异的带或者是自由探针条带！另外纯的再有探针是比溴酚蓝跑的快！
要想确定最好做个冷竞争竞争对照看看！！！这样更把握！感谢LWP1981，今天又重新做了一次，冷竞争阴性对照也做了，凝胶上下均留了，跑电泳的时间延长（低温150V、90分钟），结果发现除阴性对照外那条所谓的阳性带还在，但我觉得那条带离加样孔很近，估计
也就0.2－0.3CM，我怀疑是蛋白没跑出来孔，但我今天转膜后紫外交联（离紫外灯10CM约15分钟）时发现一个很有意思的现象，在离加样孔约1CM的地方出现一条白色带（阴性对照的这条带有点靠前），我开始怀疑是蛋白沉淀，结果封闭结合辣根过氧化物酶、漂洗后这一白色带不见了，想请问那条白色带可能是蛋白吗？还有你认为紫外交联多久（我转膜是半干转）合适，不会引起结合带被洗脱（我做了五六次，每次发现膜上非特异性带很少，几乎没有背景）？
附件内为今天做的图片，从左至右依次是冷竞争、三个样品及一个阴性对照。麻烦你再次帮我看一下。
3.tif (219.55k)非常感谢这个板块的存在，受益匪浅！做了近两个月的emsa，摸了很多的条件，都只看到自由探针的条带。突然想起有次在加样孔下面一点点有个条带，以为不是，看来是错了，以前膜的长度就四五厘米，那次有近6cm，看来是目的条带的位置没被转到膜上去。给你的意见已经回复了你的邮件了! 包括中文操作步骤,其中的试验条件,比较成熟,你可以参照一下!谢谢，但我这边有些条件不一样，实验室只有半干转仪器，另我是在紫外灯交联过程中发现离加样孔约1CM处出现一条白色带，交联后在可见光下也可见，我当时怀疑是不是反应体系内东西（如MgCL2、结合缓冲液等）盐析造成的，用封闭液封闭后就不见。你说的那个带,说真的,我还没看到过, 港开始我还以为是不是某个特异的蛋白在紫外光激发下的蛋白,似乎不是,不过封闭作用,会史非特异的杂带杂质等封闭掉!
我觉得你应该在蛋白样品上招招问题!
另外,半干转的方法,我没有用过,不过以前一个朋友用过,好像是200mA转了60min~
你可以试试!小弟买了Roche公司的&DIG gel shift kit, 2nd Generation&, 第一次做没什么经验，kit
买回来也没仔细研究，快做了才发现还要自己准备一些东西，现在就差
2) X- （Roche叫 Lumi-Film Chemiluminescent Detection Film）
3) nylon membrane, positively charged
这三样东东，Roche都有的卖，但订Roche的东西至少等1个月（小弟在南京，是博飞代理的），现在真等不及了。
有哪位大侠帮忙推荐一下那家公司这三样东西比较好，而且长年有现货的。先谢谢了！by the way,
小弟邮箱刚合成了生物素标记的NF-kB 的两条寡核苷酸引物,用什么试剂溶呢? 退火条件是什么?有人知道吗?你是在哪个公司合成的，据我所知，上海英骏合成的是用100nmol Tris-HCL,10nmol EDTA 配制，复性液（10*）为100nmol Tris-HCL,10nmol EDTA ，1mol NaCL。10ul退火体系为：两条寡核苷酸引物100nmol/ml各1ul,复性液1ul，DEPC处理的双蒸水7ul。退火条件为：65度10分钟左右，自然冷却至室温（约一小时）即可。
皮尔斯合成的探针又说退火条件为：两条寡核苷酸引物混合后维持95度5分钟，后自然冷却至室温。
第一种退火条件我用过，可以，第二种方法我一个同学用过，也可以。都可以试试。 如果担心退火条件不好，可以退火后用2ul跑一电泳看看有没有带。
记得退火后分装保存于－20度。你合成的探针一般,给你的单字上都提供融解退火条件的!!! 你可以根据他提供的条件退火!
注意, 一般不同的探针GC等含量不同,TM值稍有不同,我现在做EMSA也是用的PIERCE的试剂盒，我的protein-DNA complex好像是沉淀在加样孔里了，不知道怎么办。另外我的蛋白质是外源表达的纯化蛋白在20uL体系里加了45ng和90ng，都沉淀在加样孔里了，不
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